天然药物化学基础第二章第三节.ppt

色谱法是一种现代化的物理化学分离、分析方法。 优点三高一快 选择性高可将性质相似，结构相近的组分分开。 分离效率高能一次分离多种组分。 检测灵敏度高能分析10-1110-13g的物质，适于微量和痕量分析。 分析速度快几分钟、十几分钟、几十分钟完成分离，一次 可以测多种样品 应用范围广气体、固体、液体,1,色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今,2,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,3,基本概念 固定相在色谱分离中固定不动，对化学成分产生保留的一相。（固体或液体） 流动相色谱过程中与固定相处于平衡状态，携带待测组分向前移动的物质称为流动相。（气体或液体,4,色谱法 是利用混合物中各成分在流动相和固定相之间的作用力和亲和力（吸附，分配，离子交换、分子筛）的不同，在两相中作相对移动时，混合物中各种成分随流动相运动速度不同，从而达到相互分离的方法,5,基本概念 活化在一定温度下加热去除吸附剂中的水分，使其吸附能力提高，活性增强的过程。 去活化向吸附剂中加入一定量水分，使其吸附能力降低，活性减弱的过程。 液相色谱流动相为液体的称为液相色谱。 气相色谱流动相为气体的称为气象色谱,6,色谱法的分类,7,一）基本原理 固定相对混合物中各成分吸附能力以及流动相对各成分的解吸附能力不同； 吸附强的成分不易被流动相解吸附，移动速度慢； 吸附弱的成分易被流动相解吸附，移动速度快； *最终因为化学成分移动速度的不同而达到分离,液-固色谱法流动相液体 固定相固体,操作形式薄层色谱、柱色谱,8,吸附作用,解吸附作用,把含有A、B两组分的混合样品加到色谱柱顶端，A、B均被吸附到固定相上。（号柱,9,用适当的流动相冲洗色谱柱，当流动相流过时，已被吸附在固定相上的两种组分又溶解于流动相中，而被解吸附，并随流动相向前移进。（号柱,10,如此，随着流动相的不断冲洗，在色谱柱上不断地发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。（、号柱,11,结果使吸附能力弱的B组分先从色谱柱中留出。（、号柱,吸附能力强的A组分后从色谱柱中留出。（、号柱,12,吸附色谱法的分离效果，取决于 吸附剂（固定相）硅胶、氧化铝、活性炭） 溶剂（流动相） 被分离化合物的性质,适用于分离中等分子量（1000的脂溶性成分,13,二）吸附剂（固定相） 选择合适的吸附剂是吸附色谱法成功的关键。 良好的吸附剂应具备 不与样品及流动相发生化学反应 不溶于流动相 具有较大的表面积和一定的吸附能力。 具有一定的细度，颗粒要均匀,极性吸附剂氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅藻土、硅酸镁 非极性吸附剂活性炭,14,1.氧化铝 是一种吸附力很强的极性吸附剂。 含水量越高，吸附能力越弱。 根据含水量的多少，分为IV级,可通过活化或者去活化得到不同活度级别的氧化铝。通常在400左右加热6小时，可得III级氧化铝,15,色谱用氧化铝类型,16,2.硅胶 吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量,17,2.硅胶 吸附力比氧化铝弱。 吸附能力与游离硅醇基的数量和含水量有关。 含水量17则失去吸附能力，不可做吸附剂。 硅胶的活化 将含水硅胶在100110温度下加热30min。 温度超过500硅胶将失去活性,18,2.硅胶 特点 吸附容量大；机械强度好；分离范围广 适用范围 中性及酸性成分黄酮、蒽醌、强心苷、皂苷、有机酸、酚酸、氨基酸、挥发油。 *不适用于碱性成分的分离,19,市售硅胶 硅胶G（加入粘合剂煅石膏1422） 硅胶H（不含粘合剂） 硅胶F（加入了紫外光下能产生荧光的物质） 硅胶S（含淀粉） 硅胶GF（含粘合剂和荧光物质） 硅胶HF（不含粘合剂，含有荧光物质,20,三）溶剂（流动相） 由一种或几种溶剂混合组成。 解吸附把物质从固定相上洗脱下来,选择原则相似相溶,常用的流动相极性顺序 水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯三氯甲烷乙醚苯四氯化碳环己烷石油醚,21,极性,大,小,水,亲水性有机溶剂,甲醇乙醇丙酮,亲脂性有机溶剂,弱亲脂性有机溶剂 正丁醇乙酸乙酯,强亲脂性有机溶剂 三氯甲烷乙醚苯石油醚,22,三）溶剂（流动相） 流动相的选择,23,四）被分离化学成分 极性大 碳原子数目少 双键和共轭双键多 取代基的极性基团多,24,五）操作技术 1.薄层色谱法 步骤制板点样展开显色Rf值计算,25,步骤制板点样展开显色Rf值计算,制板 硅胶CMC板用羧甲基纤维素纳作为粘合剂铺成的薄层板。 取硅胶加适量0.5CMC水溶液13左右（g/ml），将硅胶调成糊状，倒合适的量在大小适宜的玻璃板上，控制铺板厚度在2.5mm左右，转动或借助玻棒使其分布于整个玻板表面，振动使之为均一平面，放于水平处在空气中晾干，或于105活化1小时后待用。一般情况薄层越薄分离效果越好,26,步骤制板点样展开显色Rf值计算,点样 先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为基线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。 点样要轻，不可刺破薄层,27,步骤制板点样展开显色Rf值计算,点样 先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为基线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。 点样要轻，不可刺破薄层,28,步骤制板点样展开显色Rf值计算,展开 将薄层板放入适宜的展开缸内展开。展开剂液面不要超过薄层板的基线,显色 自然光下观察、紫外光下观察、化学试剂显色,29,Rf值（比移值）计算,30,利用同一种化学成分在相同的色谱条件下Rf值相同进行定性检识,Rf值（比移值,31,只能在01之间,当Rf值为0时,表示组分留在原点未被展开，即组分在固定相上保留很牢固，组分完全不溶于流动相，不随之移动,当Rf值为1时,表示组分随展开剂移动至前沿，完全不被固定相保留,展开剂极性过小,展开剂极性过大,Rf值在0.20.8为宜，最佳范围是0.30.5,定性检识的依据 同一种化学成分在相同的色谱条件下Rf值相同,Rf值BAC,32,思考,在薄层色谱中，以硅胶为固定相，氯仿为流动相时，试样中某些组分Rf值太大，若改为氯仿-甲醇（21）时，则该组分的Rf值会变大，还是变小，为什么,Rf值会变大，因为流动相的极性增大,化合物A在薄层析上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点19cm，计算化合物A的Rf值,思考,将被分离物质和吸附剂装入大小适宜的色谱柱中，以适当溶剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱分离方法,柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相,操作步骤,35,a.干法装柱 b.湿法装柱 装柱要求 均匀紧密； 无断层； 无气泡,36,a.干法装柱,将选定的吸附剂经漏斗缓缓加入柱内，边装边用软物轻轻敲打色谱柱，使吸附剂压实，切勿将吸附剂一次性全部倒入柱中,37,b.湿法装柱,将吸附剂混悬在已选好的洗脱剂中装入柱内,38,样品易溶于洗脱剂,样品难溶于洗脱剂,将样品溶解于少量洗脱剂，制成高浓度溶液后慢慢上柱,将样品溶解于少量甲醇或丙酮后，均匀拌入适量吸附剂（1213），水浴挥干溶剂。均匀平铺至柱子顶端,39,梯度洗脱洗脱剂极性从小到大。 洗脱剂液面高度始终要高于柱面。 控制洗脱剂流速为匀速。 有色成分收集各色带洗脱液。 无色成分则采用等分收集（一般为3倍柱体积） 浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合成分则进一步分离,40,分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶剂做流动相的液-液色谱法,一）基本原理,利用被分离成分在固定相和流动相中的分配系数不同。 易溶于流动相的成分，移动速度快。 易溶于固定相的成分，移动速度慢,41,二）支持剂（载体、担体） 在分配色谱中起到支持和吸着一定量固定相的作用，本身无吸附作用。 要求不与被分离成分反应。 不溶于两相溶剂中。 常用支持剂 含水硅胶、硅藻土、纤维素、滤纸,42,分配色谱中的固定相和流动相 固定相被支持剂固定的溶剂，如水等称为固定剂。 流动相与固定相不相混溶的另一相溶剂,43,三）固定相与流动相,适用范围 正相分配色谱亲水性成分和弱亲脂性成分 反相分配色谱强亲脂性成分,分配色谱的类型 根据固定相和流动相相对极性大小不同 正相分配色谱极性固定相流动相 反相分配色谱极性流动相固定相,44,1）正相分配色谱 支持剂硅胶等 （硅胶吸水超过17，不作 吸附剂，而作为载体） 固定相强极性溶剂，如水、缓冲液等 流动相氯仿、乙酸乙酯等弱极性亲脂有机溶剂 洗脱规律极性小成分先洗下 极性大成分后洗下,2）反相分配色谱 支持剂硅胶、纤维素粉、滤纸等 固定相亲脂性极性小的有机溶剂，可用石蜡油、 反相硅胶RP-18、RP-8、RP-2 流动相则用水或甲醇等强极性溶剂 洗脱规律极性大成分先洗下 极性下成分后洗下,分配色谱的类型,四）操作技术 1、分配薄层色谱法 支持剂惰性物质 固定相支持剂吸附的溶剂 流动相事先要用固定相饱和 装置及操作同吸附薄层色谱，区别在于制板用的是支持剂不是吸附剂,48,四）操作技术 2、分配柱色谱法 先将支持剂和固定相拌匀 抽滤，除去多余的固定相（溶剂） 将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和。 湿法装柱。 洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和,49,四）操作技术 3、纸色谱法 支持剂滤纸 固定相水或者其他溶剂 流动相与固定相不混溶的其他溶剂，使用前用 固定相饱和,50,四）操作技术 3、纸色谱法 操作步骤同薄层色谱法 滤纸的准备点样展开显色Rf值计算 滤纸的准备要求平整、干净，具有一定的机械强度。 点样将样品溶解于适宜溶剂中制成一定浓度的溶液，用毛细管点样,51,3.纸色谱法 操作步骤 展开,52,3.纸色谱法 操作步骤 显色 Rf值计算,Rf值,从基线至样品斑点中心的距离,从基线至展开剂前沿的距离,53,3.纸色谱法 圆形滤纸色谱法（径向纸色谱法） 点样取一张圆形色谱滤纸，在滤纸圆心处打一小孔，然后根据所要分离的样品数目，把滤纸从圆心向外放射状的用铅笔分成若干等分，在距中心点0.5-1cm处画一圆圈，作为基线。在分好的各份中线靠近圆心处点样,54,3.纸色谱法 圆形滤纸色谱法（径向纸色谱法） 展开在点好样的圆形滤纸中间的孔内插上滤纸芯，然后将芯插入盛有展开剂的溶剂皿内，加盖，溶剂经纸芯吸上滤纸，展开开始,55,3.纸色谱法 圆形滤纸色谱法（径向纸色谱法） 定位或显色 计算Rf值,56,不同极性化合物在常见色谱法中的色谱行为,57,固定相聚酰胺 液固色谱法（吸附色谱） 聚酰胺酰胺合成的高分子化合物,基本原理 氢键吸附凡能与CO，NH形成氢键的成份都可用于分离，如酚羟基、羧酸、醌类,酰胺基,58,氢键氢原子与电负性的原子X共价结合时，共用的电子对强烈地偏向X的一边，使氢原子带有部分正电荷，能再与另一个电负性高而半径较小的原子Y结合，形成的XHY型的键,二）影响聚酰胺色谱分离的因素 关键氢键的强弱,1.溶剂的种类,聚酰胺形成氢键的能力在水中最强，在碱水中最弱。 形成氢键的能力越强，越难被洗脱下来,聚酰胺柱色谱中常用溶剂洗脱能力由弱至强 水甲醇乙醇丙酮稀碱二甲基甲酰胺尿素水溶液,60,影响聚酰胺色谱分离的因素,1）分子中能形成氢键基团的数目越多，吸附力越强,61,影响聚酰胺色谱分离的因素,2）分子中能形成氢键的基团的位置,间位对位邻位酚羟基,若形成分子内氢键，则吸附强度减少,62,影响聚酰胺色谱分离的因素,3）分子中芳香核、共轭双键越多，形成氢键能力越强,与聚酰胺形成氢键能力弱的成分，移动速度快,操作形式薄层色谱、柱色谱,63,三）实际应用 黄酮类、酚类、醌类、糖类、生物碱、萜类、甾体、氨基酸 去除鞣质,64,液-固色谱法 固定相离子交换树脂 流动相含强离子的水溶液 基本原理 离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，能可逆性的与被分离成分上的离子基团发生交换,65,固定相离子交换树脂,球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀,离子交换基团,适用范围 生物碱、有机酸、酚酸、氨基酸类成分,67,离子交换树脂的种类,阳离子交换树脂强酸性（-SO3-H） 弱酸性（-COO-H） 阴离子交换树脂强碱性（-N（CH3）3Cl-） 弱碱性（-NH2OH，-NH-，-N,阳离子交换树脂 RSO3H NaCl RSO3NaHCl 阴离子交换树脂 RNOH NaCl RNCl NaOH,可逆性离子交换,固定相 凝胶 基本原理 分子筛作用,69,凝胶,球形颗粒，三维网状结构 不溶于水，但可在水中溶胀,常用凝胶葡萄糖凝胶、 羟丙基葡萄糖凝胶、 微孔聚合物、 微孔硅胶,分离分子量大小不同的化学成分,71,洗脱顺序分子量大的化合物先流出,应用 主要用于蛋白质、核糖、多糖、甾体的脱盐精制和分离。 黄酮类、生物碱、有机酸、香豆素的分离,72,一）大孔吸附树脂法 固定相大孔树脂,73,高分子聚合物 不含交换基团 多孔网状结构 不溶于酸、碱、有机溶剂,吸附能力分子间作用力 氢键 分子筛作用,特点,原理,一）大孔吸附树脂法 基本原理 利用大孔树脂具有吸附性和分子筛作用，使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分得以分离 适用范围 生物碱、黄酮、皂苷、香豆素,74,二）气相色谱法 流动相气体 固定相液体或固体 基本原理 利用化学成分在气体与固定相之间吸附能力不同或分配系数不同的差异而分离的色谱分离方法。 适用范围沸点低、易挥发的挥发油类成分,75,三）高效液相色谱法 在经典柱色谱法基础上发展起来的一种具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法,76,小结,提取方法,溶剂提取法,水蒸气蒸馏法,超临界流体萃取法,基本原理,溶剂的种类,影响溶剂提取的因素,提取液的浓缩,提取技术,浸渍法,煎煮法,渗漉法,回流提取法,连续回流法,超声提取法,小结,分离方法,两相溶剂萃取法,沉淀法,结晶与重结晶法,色谱法,盐析法,吸附色谱法,分配色谱法,聚酰胺色谱法,离子交换色谱法,凝胶色谱法,大孔树脂色谱法,透析法,升华法,分馏法,一、选择题选择一个确切的答案 1、高效液相色谱分离效果好的一个主要原因是 A、压力高 B、吸附剂的颗粒小 C、流速快 D、有自动记录 2、纸上分配色谱, 固定相是 A、纤维素 B、滤纸所含的水 C、展开剂中极性较大的溶剂 D、醇羟基 3、利用较少溶剂提取有效成分,提取的较为完全的方法是 A、萃取法 B、加热回流法 C、透析法 D、浸渍法,4、离子交换色谱法, 适用于下列（ ）类化合物的分离 A、萜类 B、生物碱 C、淀粉 D、甾体类 5、在研究化学成分中，薄层色谱主要用于（ ） A、化学成分的分离和鉴定 B、小量样品的制备 C、探索柱层析的条件 D、以上三项均有,填空 1、存在于中草药中具有生理活性，能防病治病的单一化合物称为（ ）。 2、葡聚糖凝胶分离化合物是根据天然有机化合物的（ ）进行分离的。 3、将下列溶剂按亲水性的强弱顺序排列 乙醇、环己烷、丙酮、氯仿、乙醚、乙酸乙酯